액틴 세포골격 리모델링 프라임 RIG-I 유사 수용체 활성화

요약

매개 타고난 면역의 현재 도그마는 면역 자극 리간드의 감지가 세포 내 센서의 활성화와 인터페론  반응의 유도에 충분하다는 것입니다. 여기, 우리는 액틴 세포골격 교란이  유사 수용체 활성화를 프라이밍 한다고 보고합니다. 바이러스 감염 또는 세포 내로 전달하기 위해 일반적으로 사용되는 시약에 의해 유도된 액틴 세포골격 재배열은 단백질 포스파타제-1(PP1)의 조절 서브유닛인 재편재화를 촉발합니다. 이것은 탈인산화 매개 프라이밍을 허용하고 작용제와 함께 효과적인 RLR 다운스트림 신호 전달을 유도합니다. 유전적 절제 항바이러스 반응을 손상시키고, 인플루엔자 바이러스, 피코 르나 바이러스, 수 포성 구내염 바이러스를 포함한 여러 바이러스 감염에 대한 감수성을 높입니다. 우리의 연구는 항바이러스 또는 보조제 설계를 위한 길을 열 수 있는 매개 타고난 면역에 대한 프라이밍 신호로 액틴 세포골격 장애를 식별합니다.

 

소개

바이러스 감염 에 대한 선천성 면역의 활성화는 세포질 또는 핵에 상주하거나 막에 묻혀 있는 패턴 인식 수용체라고 하는 특수 센서 단백질에 의해 매개됩니다. 많은 PRR은 특정 기능을 가진 바이러스 또는 숙주 유래 핵산을 감지하고, 인식 시 I형 인터페론과 같은 사이토카인의 전사 유도를 유발합니다. 세포질 RNA 센서의 RIG-I 유사 수용체(RLR) 제품군은 다양한 세포 유형에서 다양한 바이러스를 감지하고 제한합니다. RIG-I 및 관련 수용체 구성된 보존된 도메인 구조를 공유하며 , 둘 다 RNA agonist와  신호전달을 매개하는데 관여합니다. 미토콘드리아 항바이러스 신호 단백질을 통해 광범위한 연구는 RLR이 RNA 작용제에 의해 활성화되는 방식과 번역 후 변형이 RLR 활성화를 조절하는 방식을 이해하는 데 중점을 두었습니다. 아세틸화 는 RIG-I의 RNA 감지 능력을 조절하는 반면, 인산화 및 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 유사 단백질의 변형은 RLR 신호 전달을 조절합니다( Chiang and Gack, 2017 ). 세린 8(S8)(및 기타 잔기)에서 RIG-1의 인산화 및 세린 88(S88)에서 MDA5의 인산화는 감염 전에 RLR 활성화를 금지하는 반면 , 세포 단백질 포스파타제-1 PP1α 또는 PP1γ에 의한 이들 부위의 탈인산화는 바이러스 감염에 대한 RLR 활성화. CARD 탈인산화는 RLR 다량 체화, MAVS 결합 및 다운스트림 신호 전달을 촉진하는 K63 연결 유비퀴틴화 (RIG-I) 및 ISGylation(MDA5)의 전제 조건입니다.  그러나 바이러스 감염 시 PP1α/γ 자체가 어떻게 활성화되는지는 알려져 있지 않습니다. 더욱이, PP1은 RLR의 탈인산화뿐만 아니라 다른 많은 세포 기질의 탈인산화를 촉매 하기 때문에 RLR에 대한 특이성을 결정하는 것이 무엇인지 불분명합니다. 촉매 코어인 PP1의 기질 특이성 은 >200개 이상의 PP1 조절 단백질 중 하나와의 복합체 형성에 의해 부여되며, 이들 중 다수는 기능적으로 특성화되지 않았습니다. 특히, 어떤 PP1 조절 단백질이 PP1α/γ에 의한 RLR 표적화를 매개하는지 알려져 있지 않습니다.

바이러스는 진입, 세포내 수송 , 비리온 조립 및 유출과 같은 수명 주기의 정의된 단계에서 숙주 세포의 액틴 세포골격을 이용하고 개조하도록 진화했습니다. 예를 들어, 코로나바이러스 및 인플루엔자 A 바이러스를 포함한 많은 바이러스의 거대음 세포작용 또는 세포 내이 입 매개 진입은 피질 액틴 재배열을 필요로 합니다. 인간 면역 결핍 바이러와 같은 다른 바이러스는 액틴 역학을 유발하여 진입을 촉진하는 케모카인 공 수용체와 결합합니다. 나중에 감염 동안 필라멘트 액틴(F-액틴)은 원형질막 마이크로 도메인을 안정화하여 비리온 조립 및 출아를 촉진할 수 있습니다. 액틴 역학 및 스캐폴딩 기능의 바이러스 전복이 잘 문서화되어 있지만 바이러스에 의한 액틴 세포골격 리모델링이 숙주의 면역 감시 기계에 의해 감지될 수 있는지 여부는 알려져 있지 않습니다.

여기에서 우리는 RLR에 대한 PP1α/γ의 특이성이 F-액틴 상주 PP1 조절 단백질에 의해 매개된다는 것을 보여줍니다. 우리는 바이러스 매개 액틴 세포골격 교란이 PP1-R12C 포스파타제 복합체에 의한 RLR 탈인산화를 유발하고 RNA 리간드에 의한 활성화를 위해 RLR을 프라이밍하여 면역자극 RNA와 바이러스 유도 액틴 세포골격 리모델링을 모두 필요로 하는 RLR에 대한 2-신호 활성화 모드를 공개한다는 것을 확인했습니다. 

결과

우리는 특정 PP1 조절 단백질 이 바이러스 감염 후 RLR에 대한 PP1α/γ를 표적으로 한다고 가정했습니다. PP1α/γ를 RLR 활성제로 식별한 RNAi 포스파톰 스크린에서 8개의 후보 PP1 조절 단백질도 나타났습니다. 이들 중 어느 것이 RLR 활성화를 직접 매개하는지 또는 RLR의 다운스트림에 작용하는지 확인하기 위해, 우리는 RIG-I 및 MDA5의 CARD 도메인에 의해 유도된 IFN-β 프로모터 활성화에 대한 이러한 후보 PP1 조절 단백질의 siRNA 매개 녹다운 효과를 분석했습니다. RIG-I(2 CARD) 및 MDA5(2 CARD)) 또는 공통 다운스트림 신호 어댑터 MAVS ( 그림 1A 및 S1 A). 비 표적화 대조군 siRNA 형질 감염과 비교하여, R12C의 침묵은 RIG-I(2 CARD) 또는 MDA5(2 CARD)에 의해 유도된 IFN-β 프로모터 활성화를 감소시켰지만 MAVS는 감소시키지 않았으며, 이는 R12C가 RLR 수준에서 작용함을 시사한다. 대조적으로, 다른 PP1 조절 단백질의 고갈은 RIG-I(2 CARD), MDA5(2 CARD) 및 MAVS에 의해 유도된 신호 전달을 감소시켰으며, 이는 이들이 MAVS의 수준 또는 다운스트림에서 작용하거나 기본적인 세포 과정에 영향을 미친다는 것을 시사합니다. R12C를 억제하지만 다른 PP1 조절 단백질은 억제하지 않고 RIG-I(S8에서) 및 MDA5(S88에서)의 인산화가 PP1α/γ 결핍과 유사한 수준으로 인산화 감소(탈인산화 감소를 나타냄)를 강화했습니다( 그림 1B 및 S1비). 내인성 R12C의 고갈은 또한 외인성 전장 RIG-I 또는 MDA5에 의해 자극된 IFN-β 프로모터 활성화를 PP1α/γ 또는 IRF3의 녹다운만큼 효율적으로 감소시켰 으며, 후자는 대조군으로 작용한 IFN 유도의 핵심 전사 인자입니다. 그림 1C, 1D 및 S1C ). 내인성 R12C의 고갈은 또한 합성 dsRNA(폴리(I:C)-LyoVec)와 복합된 합성 dsRNA 고분자량 폴리 이노신-폴리 시티 딜산으로 자극하거나 SARS-CoV-2(SCoV2) 감염 후 IFN-β 반응을 손상시켰습니다. (둘 다 주로 MDA5를 활성화함) ( Kato et al., 2006 ; Liu et al., 2021 ; 그림 1E, 1F 및 S1D). 또한, R12C 녹다운은 수포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 NS1 유전자가 결여된 재조합 IAV (IAVΔNS1)(둘 모두 RIG-I에 의해 감지됨)( Gack et al., 2009 )에 의한 감염에 대한 반응으로 항바이러스 유전자 유도를 수준까지 감소시켰습니다. RIG-I 또는 IRF3의 사일런싱과 비슷합니다. 우리는 또한 RIG-I와 MDA5에 의해 감지되는 ZIKV에 의해 촉발된 IFN 유도에 대한 R12C 녹다운의 효과를 테스트했으며 대조군 siRNA-형질 감염 세포와 비교하여 R12C-고갈 세포에서 감소된 IFNB1 전사체를 발견했습니다. 특히, R12C 침묵은 다음에 의해 유발되는 IFN-β 프로모터 활성화에 영향을 미치지 않았습니다 DNA 센서 순환 GMP-AMP 합성효소 (cGAS) 및 인터페론 유전자의 어댑터 자극기 (STING)의 이소성 발현 ( 그림) 또는 폴 리데옥시아데닐산-폴리 데옥시 티미딜산(폴리(dA:dT))-LyoVec 자극 유도에 R12C의 일반적인 영향을 받습니다.